新闻 | 全球首款mRNA RSV疫苗获批上市之际，翌圣镁孚泰改造T7 RNA聚合酶的最新研究成果mRNA应用的安全性再上一重保障！

在37°C下，等摩尔单链DNA与分子信标孵育后，荧光强度随着与荧光序列互补的碱基增多而显著提升，不形成末端回环的Run-off RNA信号最高，而无互补区域的DNA（模拟不完整mRNA）荧光最低（图2A）。这表明荧光探针可区分RNA的构象，在IVT反应中，dsRNA或不完整RNA生成越少，荧光也就越高，因此可依据荧光强度筛选优势突变体。为了能高效筛选T7 RNAP，研究团队选用荧光激活液滴分选技术(FADS)来满足蛋白质进化的高通量需求。同时为了防止细胞过早破裂，采用双水相PDMS芯片实现细胞与溶菌酶的混合（图2B），液滴收集后于37°C孵育以促进细胞裂解和RNA转录。

图2.FADS筛选^[2]

通过易错PCR技术构建了几个介于10^5至10^6之间的随机突变体库，在这些库中，T7 RNAP的表达被诱导，并生成了液滴以供进一步分析。利用分选芯片，筛选出荧光强度高于特定阈值的阳性液滴。通过PCR扩增，从这些阳性液滴中提取的DNA样本随后被用于下一代测序（NGS）分析。通过筛选并纯化了包含目标位点的蛋白质，得到了命名为Mut1至Mut10的T7 RNAP变体。进一步分析这些变体转录产物中的dsRNA含量。如图3A和图3B所示，突变体Mut1（突变位点V214A）、Mut7（F162S/A247T）和Mut9产生的dsRNA含量显著低于野生型，其中Mut9产量不能满足需求。

图3.随机文库筛选和突变体评估（dsRNA免疫印迹，以5μL ddH2O为阴性对照）^[2]

促进T7 RNAP的构象转变可以在一定程度上避免abortive RNA的积累，进而减少dsRNA副产物^[3]。这一策略可通过降低延伸构象的折叠自由能，并增强延伸复合物的稳定性来实现，最终利于run-off RNA的产生。基于此，研究团队通过半理性设计方法，构建了十个单点饱和突变库，并利用传统的微孔板筛选技术来识别有益的变体。其中，微孔板筛选使用了双探针，增加的5’-end探针用于检测RNA产量。

图4.减少dsRNA的结构导向半理性设计^[2]

在筛选超过1000个突变体后，发现了候选突变体：Mut11 (K180E)、Mut12 (S228F)、Mut13 (G238L)、Mut14 (A70Q)、Mut15 (A383H)和Mut16 (I743L)。其中突变体Mut11和Mut14的dsRNA含量显著低于野生型（图5）。与此同时，六种突变体产生的总RNA产量与野生型相当，说明转录效率未受影响，5’end探针发挥了预期的作用。

图5.微滴板筛选和突变体评估^[2]

为了进一步优化T7 RNAP，研究团队选择了四个低dsRNA副产物且总产量达标的突变体。这些突变体在五个关键位点有特定突变：V214A、F162S、A247T、K180E和A70Q。然后，构建了一个包含大约500个克隆(理论上包含120种突变类型)的DNA Shuffling文库。通过微孔板筛选，鉴定出了一个与亲本T7 RNAP相比产生更少dsRNA的Mut17(A70Q/F162S/ K180E）。

接着，对突变体Mut17和其亲本变体Mut14、Mut11、Mut7的转录产物进行分析。结果显示（图6），这些变体与野生型相比dsRNA产量显著减少，Mut11的dsRNA含量为野生型的7.28%，Mut14和Mut7分别为3.49%和3.31%。Mut17的dsRNA含量更低，仅为野生型的1.80%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。

图6.Mut7、Mut11、Mut14、Mut17与WT的dsRNA检测^[2]

为探究突变体的免疫原性，研究团队在小鼠RAW264.7细胞中进行体外转录（IVT）产品的免疫原性评估，并在HEK293细胞中检测了EGFP mRNA的表达。如图7A和图7B所示，野生型T7 RNAP合成的RNA引发了最强烈的免疫反应，而来自突变体的RNA则显示出较弱的反应。具体来说，用突变体Mut11 RNA处理的细胞IFN-β mRNA仅为用野生型处理细胞的9.7%，其蛋白表达量为12.93 pg/mL。此外，不同T7 RNAP生成的mRNA在EGFP表达的数量和质量上没有显著差异（图7C），满足了工业应用要求。

图7.哺乳动物细胞中IFN-β反应与EGFP表达^[2]

通过计算机模拟，研究者们探索了氨基酸替换对突变体T7 RNAP降低dsRNA的内在原因。模拟结果暗示突变体的RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性降低，这归因于它们减少了对RNA模板的亲和力。此外，这种变化可能还影响了T7 RNAP的末端转移酶活性^[4]。研究者设计实验来测试T7 RNAP的相对RDRP活性，在不同浓度下，所有4种变体的荧光值均低于野生型的50%（图8）。

图8.相对RDRP活性^[2]

另一方面，通过3'末端异质性测定法分析T7 RNAP的末端转移酶活性。结果显示（图9），在野生型中，n>0的RNA占82.94%，而突变体Mut11、Mut7、Mut14和Mut17分别为70.29%、67.88%、63.31%和55.62%，且这些比例变化趋势与dsRNA丰度趋势一致 （图6）。这些发现指出，突变体的RDRP和末端转移酶活性有所下降，这有助于减少dsRNA的形成。特别是突变体Mut17展现出最低的末端转移酶活性，相应地，它也产生了最少的dsRNA（图6和图9）。

图9.RNA产物3 '端的异质性^[2]

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