干货 | 镁孚泰酶改造技术经验分享：半理性设计全流程实战解析！

2025-06-20 13:31 Molefuture

蛋白质半理性设计通过整合结构信息与进化筛选，打破传统定向进化的盲目性，成为提升酶活性、热稳定性及底物特异性的核心策略。本文将按“锁定靶点区域、优选残基、设计突变库和筛选验证”四大关键环节，拆解实战技巧，揭秘如何通过结构分析缩小突变范围、计算工具预测高价值残基、简并密码子优化文库效率以及三级筛选体系精准识别优势突变体，助您在酶改造研究中少走弯路。

图1：蛋白质半理性设计工作流程示意图。

如何快速锁定靶点区域？

# 1、获取高质量蛋白三维结构

首选PDB数据库中的实验结构，若无则可使用AlphaFold2, RoseTTAFold等高置信度预测模型预测结构，同时可关注结合/未结合(apo/holo)等多构象状态。

# 2、深入挖掘结构信息

1)重点关注活性口袋(底物结合位点、催化中心、辅因子结合位点)和底物/产物通道(底物进入、产物释放路径)区域。
2)构象变化大的柔性Loop (特别是“盖子”或“门控”loop)、分子动力学模拟(MD)识别的高B因子(波动大)区域及亚基或结构域接触界面(涉及组装和别构调控)等动态区域常常对酶的性能有重要影响。
3)对氢键网络、盐桥网络、疏水核心、二硫键等关键相互作用力的深入分析有助于找到潜在的突变靶点。

# 3、进化与保守性分析

1)多序列比对(MSA)识别高度保守(功能关键)和高度可变(可塑性高)区域。

2)共进化分析识别功能/结构相关的残基对/网络(如用EVcoupling)。

3)比较同源不同功能蛋白的结构差异点。

# 4、聚焦“热点”区域

首选对功能(活性、特异性、稳定性)有潜在间接影响的区域，避免直接破坏催化中心或关键相互作用的核心。

如何选择关键残基？

选择突变残基应遵循理性优先、适度扩展的原则进行，具体的策略如下：

# 1、在核心区域选择

1）催化口袋边缘的残基(不直接催化，但影响底物定位)。

2）通道入口/出口处的残基(影响底物进入/产物释放速率)。

3）靠近关键催化残基或结合残基(~5Å内，“第一配位圈”)，影响微环境(电荷、疏水性、空间)。

4）柔性Loop中可能调控构象或稳定性的关键残基。

5）亚基界面参与相互作用的非核心保守残基。

# 2、基于计算结果选择

1）使用FoldX预测ΔΔG能量变化的热点。

2）MD模拟中显示关键相互作用频繁变化的残基。

3）深度扫描(结合DDGun, PopMusic等工具预测点突变影响)。

# 3、基于实验初筛结果选择

1）丙氨酸扫描：快速识别功能关键(Ala突变失活严重)或可塑性高(Ala突变影响中度)的残基，后者常是优化好靶点。

2）功能区域截断/扫描：初步锁定关键Loop或片段。

# 4、基于进化信息选择

1）在共进化网络中处于中心节点或与功能关键残基强关联的残基。
2）MSA中在目标功能（如热稳定性）上出现正选择信号的非保守残基。
3）在进行残基选择的时候要控制数量与间距。单库聚焦1个区域(如“底物通道入口”)或少量(2-4个)邻近/协同的残基组合。避免对连续长片段(>3个残基)同时饱和突变(易破坏折叠)。组合库中，优选非连续或有间隔的残基组合(降低冲突)。

如何高效设计半理性突变文库？

通过使用简并密码子构建文库可提高筛选效率与命中率。

1）如NNK可覆盖所有20种氨基酸，文库大(~96个克隆/位点)。

2）NDT可编码Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Ser, Gly, Cys, His, Asn, Asp, Arg, 包括芳香族、疏水、亲水、正电、负电等各种氨基酸类型。

3）DNT可编码Tyr, Phe, Val, Ala, Ile, Ser, Gly, Thr, Cys,Asn, Asp等11种氨基酸，同样具有很高的代表性，可与NDT交替使用。

4）使用组合活性中心饱和测试(CAST, combinatorial active-site saturation test）可以筛选出具有协同构象作用的突变位点组合。

5）在CAST的基础上进行迭代饱和测试（ISM, iterative saturation test），可以快速产生丰富结构多样性的有益突变。

6）基于蛋白质框架的结构重组（SCHEMA）是一种利用同源结构元件交叉重组策略进行蛋白质理性设计的方法，其核心在于通过模块化重组打破传统结构域重组的限制，尤其适用于低同源亲本间的功能整合。

表1：在无密码子偏好性条件下，覆盖95%文库NNK和NDT所需采样量对比。

Ref.: Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 138−174.

如何对半理性文库进行高效筛选？

# 1、构建可筛选系统

1）表达系统：

优化宿主(常用大肠杆菌、酵母)和表达条件(温度、诱导剂、时间)，保证功能性可溶性表达是筛选前提。
2）筛选方式：

遗传互补、发酵上清/细胞裂解液中显色/荧光底物的直接测定、抗生素抗性筛选(需设计好剂量)、表面展示等体内筛选通量极高，但易得假阳性/假阴性。
B在96/384孔板表达纯化后酶活测定/高通量生化检测(显色/荧光/GC/HPLC-MS)、热漂移法检测Tm等体外筛选结果更可靠，但通量受限于表达/纯化步骤。

# 2、分层筛选策略

1)一级筛选(Primary Screen)

目标：从海量库中快速富集潜在阳性，去除绝大部分无效克隆。
规模：几百到几千个克隆。
要求：高通量(96/384孔板)、速度快、成本低，精度可稍低。
方法：显色法(微孔板读数)、基于荧光的活性测定、简单的抗性/颜色生长筛选等。
关键：设定合理初筛阈值(如活性>WT均值+2SD)并平行复孔(2孔)减少误差。

2)二级筛(Secondary Screen)

目标：确证一级筛选阳性、定量比较、排除假阳性。
规模：几十到几百个克隆。
要求：更高精度、重现性、定量性，可加入第二关注的性能等指标。
方法：小量表达纯化后或使用高质量裂解液进行筛选。
关键：与野生型平行严格对照。建议测序验证突变。

3)三级筛(Tertiary Assay)

目标：对最优克隆(5-10个)进行全面生化表征和应用潜力评估。
方法：大量表达纯化，全面测定详细酶动力学参数、稳定性、选择性、特异性、产物抑制、储存稳定性等目标性能。

半理性设计是一个迭代优化的过程。扎实的结构分析、明智的残基选择、高质量的文库构建和严谨的分层筛选，是成功的基石。实验不会总是一帆风顺，遇到假阳性率高、提升效果不明显等问题时，可以回溯锁定靶点、优选残基、设计突变库和筛选验证这四大环节，检查参数优化（如筛选条件、文库覆盖度）和策略选择（如是否需更换靶点区域）。将每一轮筛选获得的有效信息反馈给下一轮设计和迭代，才能逐步逼近目标性能。

关于镁孚泰生物

镁孚泰生物科技（上海）有限公司（镁孚泰生物，Molefuture）是翌圣生物科技（上海）股份有限公司旗下的全资子公司，是一家以酶进化技术为驱动、专注于提供酶改造定制化解决方案的创新型企业。依托于翌圣生物，镁孚泰生物现有六大技术平台：ZymeEditorTM创新型酶进化平台、多宿主高效表达平台、发酵工艺开发平台、纯化工艺开发平台、UCF.ME^®超洁净酶生产平台以及酶分析与质控平台。基于这六大技术平台，镁孚泰生物可提供酶定向改造、新酶开发、酶工艺开发以及GMP级别规模化生产的全套定制解决方案，以满足酶在体外诊断、生物医药、合成生物、医疗美容、医药中间体等领域的应用需求。

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