干货 | 蛋白生物传感器高通量筛选方法助力代谢酶的挖掘与进化！

2024-04-03 11:21 Molefuture

Introduction

前言

自19世纪下半叶以来，人类在基因技术、工程科学、合成化学、系统生物学及计算机科学等多个科学领域取得了重大突破。这些学科的交叉融合，极大地推动了合成生物学的发展。进入21世纪后，合成生物学的影响力日益扩大，尤其在近年来，它已引起了人们的广泛关注和热切期待。

合成生物学的主要任务之一是通过代谢工程方法，生产出人类社会所需的各类化学品。这一过程往往依赖于细胞内天然存在的或经人为巧妙组装的酶元件集，这些元件在细胞内部负责实现特定的代谢功能。然而，通过细胞代谢合成化学品的效率往往很难满足工业化生产的需求。从不同的基因组库中鉴定新酶或改进现有的天然酶的性能(活性、稳定性、选择性等)可以帮助开发新的代谢途径或增强现有途径，从而进一步提高目标代谢产物的产量。

如何快速有效地从庞大的酶库或突变文库中筛选出具有所需性能的酶或有益变体，对于发现新酶或改进现有天然酶至关重要。传统酶性能的定性和定量分析主要依赖液相色谱、气相色谱、质谱等，这些方法费时费力，难以实现高通量筛选。因此，研究人员开发了很多基于底物、产物或其对应衍生化合物具有的紫外或荧光特性而建立的一系列光化学分析技术，大大提高了筛选的通量，这些方法已广泛应用于酶工程、代谢工程等领域(图1)。然而，并不是所有的底物或者产物都具有显著的显色特性，也并非所有的代谢物都可以通过酶级联策略进行间接测定。为了实现更多酶或有益突变体的快速鉴定，研究人员基于各项技术开发了越来越多的高通量筛选方法(HTS, High-throughput screening)，大幅度加速了在不同场景下对海量酶库中目标酶的高效筛选。

图1.基于辣根过氧化物酶(HRP)的酶级联反应产物显色方法，实现人类精氨酸酶1(hArg1)活性的高通量筛选

(图片源自：doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05429)

在构建宏基因组或酶突变文库后，可通过基因编码的生物传感器将酶的性能与表观信号(如荧光和抗生素耐药性)进行偶联，从而实现对庞大文库的快速筛选。经过巧妙设计的基因编码的生物传感器可以发现性能优异的新型酶，或者根据进化目标筛选得到催化效率、催化特异性和催化选择性提升、反馈抑制降低以及稳定性或溶解度改善的有益突变体(图2)。相比于传统的筛选方法，基于生物传感器的策略往往能够实现真正意义上的超高通量筛选(图3)。

图2.基于生物传感器实现代谢酶的挖掘及性能改造

(图片源自：doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108251)

图3.基于生物传感器的高通量方法能够实现庞大文库的快速筛选

(图片源自：doi.org/10.1016/j.copbio.2018.01.011)

如图4所示，基因编码的生物传感器由两个主要元件组成：一个能够检测目标代谢物的传感模块(Sensing module)和一个提供输出信号定量指示的输出模块(Output module)，该信号与靶代谢物的浓度成比例。根据传感模块的类型，基因编码的生物传感器又可分为“基于蛋白的生物传感器”和“基于RNA的生物传感器”。基于蛋白的生物传感器按传感器件组件或激活机制分为四种亚型：转录因子(Transcription factor)、荧光共振能量转移(FRET)、偶联酶(Enzyme)和分裂蛋白(Split protein)；基于RNA的生物传感器有两种亚型：核糖开关(Riboswitch)和核酶(Ribozyme)。输出信号通常分为荧光、生物发光、比色和抗体抗性等。本期我们将主要为大家介绍其中基于蛋白的生物传感器高通量筛选方法。

图4.基于传感组件类型的基因编码生物传感器

(图片源自：doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108251)

基于转录因子的生物传感器

转录因子(TF)的一大类是蛋白质调节因子，由两个结构域组成：检测配体存在的配体结合域(LBD)和DNA结合结构域(DBD)。一旦目标配体与LBD结合，它会导致TF发生结构变化，这种变化可以导致DBD结合或脱离DNA的操纵基因序列，进一步激活或抑制下游遗传元件来调节报告基因的表达(图5)。输出信号可以表现为荧光(荧光蛋白)、生物发光(荧光素酶)、比色法(β-半乳糖苷酶)或抗生素耐药性(抗生素耐药蛋白)，这些形式易于检测。输出信号的强弱通常与配体化合物的种类及浓度呈相关性。

图5.基于转录因子的生物传感器工作原理

(图片源自：doi.org/10.1016/j.copbio.2018.01.011)

Ho等研究人员设计了一种基于TF生物传感器用于筛选可以将木质素转化为两种商业上重要的单芳香族化合物香兰素和丁香醛的代谢菌株。该生物传感器中包括大肠杆菌emrRAB操纵子的转录调节因子和启动子，以及报告基因绿色荧光蛋白(GFP)。大肠杆菌内源表达的转录调节因子EmrR结合到emrRAB的启动子-操纵子序列上后会抑制GFP基因的转录(“OFF”状态)，一旦经过香兰素等单芳香族化合物的诱导，EmrR转录调控因子的抑制即被解除，从而启动GFP的转录(“ON”状态) (图6)，此时可以通过GFP的荧光信号强度来反应细胞内香兰素的生成浓度。作者利用该生物传感器筛选了从两个煤床中分离到的42520个克隆，从中成功鉴定出了147个可以将硬木硫酸盐木质素转化为香兰素和丁香醛的菌株。

图6.用于香兰素代谢菌株筛选的基于TF的生物传感器

(图片源自：doi.org/10.1021/acssynbio.7b00412)

基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器

荧光共振能量转移是两个具有重叠光谱的荧光蛋白之间在近距离(<10 nm)发生的能量转移的物理现象，基于此可设计基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器。用青色荧光蛋白(CFP, Cyan Fluorescent Protein)作供体，黄色荧光蛋白(YFP, Yellow Fluorescent Protein)作受体是最适合用于设计FRET生物传感器的一对组合，因为CFP发射光谱部分重叠了YFP的激发光谱(图7)。当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率对空间位置的改变非常灵敏，与它们之间空间距离的6次方成反比。

图7.CFP和YFP的光谱重叠图
(图片源自：Selecting Filters for Fluorescence Multiplexing)

通过基因方法将CFP、YFP与目标蛋白进行融合，常态下CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476 nm的荧光；但当目标蛋白与底物分子发生相互作用时，目标蛋白会发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527 nm的荧光(图8)。

图8.基于外周结合蛋白MglB的基因编码的葡萄糖FRET传感器

(图片源自：doi.org/10.3390/s140711691)

Brown等人开发了基于FRET的生物传感器用于SARS-CoV-2蛋白酶抑制剂的高通量筛选。病毒的RNA在翻译时，会最先合成一个分子量很大的前体蛋白，该前体蛋白被进一步切割，产生多种成熟的小分子量蛋白参与子代病毒的组装和释放。在这个过程中，3CL蛋白酶起到关键作用。理论上可以通过抑制3CL蛋白酶的活性，导致蛋白前体不能被切割并参与组装形成成熟的病毒体，那么病毒自然就不能进行自我复制了。作者选择了荧光蛋白eCFP和Venus用于构建FRET生物传感器。使用多肽序列TSAVLQ↓SGFRK连接荧光蛋白eCFP和Venus，该多肽Linker中包含蛋白酶SARS-CoV-2 3CL的切割位点。在完整的生物传感器中，当以434 nm激发eCFP时，由于eCFP和Venus距离近发生了荧光共振转移，导致Venus在528 nm处发射荧光。当SARS-CoV-2 3CL存在时会对Linker进行切割，从而导致eCFP和Venus分离，FRET现象停止发生，最终只能在477 nm处检测到eCFP发射的荧光信号(图9)。基于此生物传感器，作者从1280 种活性药物化合物库中成功筛选到了65种3CL蛋白酶抑制剂。

图9.基于FRET生物传感器用于蛋白酶抑制剂的筛选

(图片源自：doi.org/10.3390/molecules25204666)

基于偶联酶的生物传感器

除了上述两种基于TF和FRET的蛋白生物传感器，使用基于酶的生物传感器也是酶进化领域中常用的筛选策略。常规底物经目标酶催化后生成的产物往往无显著的光谱特性，此时可以在筛选体系中偶联另外一种酶，该酶可以进一步催化前序产物转化为有显著光谱特征的衍生物用于目标酶活的间接分析(图10)。在该体系中，偶联的酶活性应该远大于目标酶的活性，不能成为多酶级联反应过程中的限速酶，最终目标酶活性与检测到的光学信号呈正相关性。

Frances H. Arnold课题组在进化萜烯合酶环化的工作中建立了一个基于偶联酶生物传感器用于检测环化副产物甲醇的高通量筛选方法。在萜烯合酶反应体系中添加醇氧化酶(AOX)，可以在分子氧存在下将反应副产物甲醇转化为甲醛，生成的甲醛可以和随后加入的Purpald试剂反应生成一种蓝紫色的化合物(图10)，在550 nm处即可读出其吸收值，该方法可测定浓度在20~250 μM范围内的甲醇。通过定向进化与该高通量筛选方法的结合，作者成功将萜烯合酶的热稳定性提高了12℃。

图10.基于酶偶联的生物传感器用于萜烯合酶催化产物甲醇的定量分析

(图片源自：doi.org/10.1002/anie.201301362)

基于分裂酶的生物传感器

另外一种有趣的蛋白生物传感器是基于分裂酶的生物传感器，而其中应用最为广泛的就是基于分裂的GFP生物传感器，多用于突变体酶的热稳定性或可溶性表达的高通量筛选。基本原理如图11所示，将GFP分裂成两个大小不等的互补片段(GFP_1-10和GFP₁₁)，这两个片段单独存在时均无荧光信号产生，当这两个片段相遇时会自发结合形成一个完整的GFP蛋白并发出绿色荧光。由于完整的GFP蛋白分子量较大，若将其直接与我们的目标蛋白融合表达往往会影响目标蛋白的活性，而小的GFP₁₁片段已被实验证明不会显著影响目标蛋白的表达和活性。将我们的目标蛋白(X)通过柔性接头(L)与小的GFP片段(GFP₁₁）融合表达，互补的GFP大片段(GFP_1-10)单独表达。若融合GFP₁₁的目标蛋白以可溶形式表达时，GFP₁₁和GFP_1-10即可结合并产生绿色荧光，且荧光值与可溶性蛋白的量呈正比。若融合蛋白不能够正确折叠、以不可溶形式表达式，则不可溶的GFP₁₁标签将无法与GFP_1-10结合，从而无荧光信号产生(图11)。基于此，通过比较荧光信号值的大小就可以区别蛋白突变体之间可溶性表达水平的差异。

图11.分裂GFP生物传感器用于酶的可溶表达筛选

(图片源自：doi:10.1038/nbt1044)

蛋白质定向进化技术是获得高性能突变酶的有效手段，然而在进行高活性突变体筛选的过程中，突变体与母本之间常常存在蛋白可溶表达水平的差异，从而出现了假阳性或假阴性的结果，使得好的突变体被遗漏、差的突变体反而被收集并要耗费大量的精力去重新表达、纯化、表征这些假阳性突变体，大大降低了定向进化的效率。为了解决这一通用性的难题，Uwe T. Bornscheuer课题组将分裂GFP技术与突变体酶活筛选过程巧妙地结合起来，有效的解决了上述难题。如图12所示，他们参照图11的操作使用接头将目标酶的基因与GFP₁₁基因进行融合表达，将GFP_1-10基因单独表达。将融合了GFP₁₁标签的突变体在96孔板中表达裂解后，一部分样本用于突变体酶活性的筛选，另一部分则用于荧光检测突变体的可溶表达水平，酶活性数值与荧光数值的比值反应了突变体比活力的高低。通过这一策略即可实现高比活突变体的准确筛选，他们已经将该策略成功应用到了转氨酶、环己酮单加氧酶等酶的突变文库的筛选中。

图12.分裂GFP生物传感器助力高比活突变体的准确筛选

(图片源自：doi.org/10.1016/j.chembiol.2015.08.014)

总结与展望

基因编码的生物传感器在酶工程、代谢工程、药物筛选等领域的应用日益广泛。相比传统的方法如色谱分析、紫外检测等，基于生物传感器的策略往往能够实现真正意义上的超高通量筛选，大大提高了酶的挖掘、改造及药物筛选等工作的效率。

基因编码的生物传感器由传感模块和输出模块两个主要元件组成，如何为特定目标酶巧妙地选择和设计合适的模块以实现基因文库的快速、准确筛选，是设计基于生物传感器高通量筛选方法所需面临和解决的首要问题。根据传感模块的类型，基因编码的生物传感器分为“基于蛋白的生物传感器”和“基于RNA的生物传感器”。本次主要介绍的是基于蛋白的生物传感器，按传感器件组件或激活机制的不同，分为四种亚型：基于转录因子的生物传感器、基于荧光能量共振转移的生物传感器、基于偶联酶的生物传感器以及基于分裂蛋白的生物传感器，在实际应用中可根据靶蛋白的性质选择合适的基于蛋白的生物传感器高通量筛选方法。同时，在设计和应用这些生物传感器的过程中还需考虑传感器与工作体系的兼容性、传感器的信噪比等问题。

基于蛋白的生物传感器的输出模块多可以输出荧光信号，因此如果将这些蛋白生物传感器与某些新型装置整合到一起，就有可能进一步提高生物传感器高通量筛选的效率。例如，液滴微流控系统可以在短时间内生成大量的“油包水”微液滴，每个微液滴可以分别包裹一个突变体细胞，从而生成一个个微小的生物反应器，极大提高了筛选效率。这种将基于蛋白的生物传感器与微液滴系统整合在一起的系统有望广泛应用于酶的挖掘或改造，从而大大加速酶工业的发展。

尽管基于蛋白质的生物传感器具有很多优势，但仍面临一些挑战。首先，生物传感器中蛋白质的表达可能会造成意想不到的代谢负担。此外，基于蛋白质的系统对其反式调节操作的反应中可能会出现延迟。基于蛋白质的生物传感器中调节元件的表达会影响细胞内的内源性调节系统。同样，细胞中的内源性调节元件有可能激活生物传感器输出模块的表达，导致在选择过程中产生假阳性。应对这些挑战对于提高基于蛋白质的生物传感器的性能和适用性至关重要。随着生物技术的快速发展和迭代，相信未来这些挑战必将被一一克服，届时将会有越来越多、越来越好的基于蛋白质生物传感器的高通量筛选方法被开发出来并应用到酶工程和代谢工程等领域，助力代谢酶的挖掘与进化，推动合成生物学的快速发展。

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